Sotto il pontificato di Gregorio XIII, intorno all'anno 1575, vengono realizzati la Chiesa e il Convento dei Cappuccini, in concomitanza della costruzione delle ville, in Frascati, abitate dalla cerchia di persone vicine al Papa, le quali furono sostenitrici della sua realizzazione anche se in zona appartata. Lo stesso comune di Frascati ne sollecita la realizzazione nel 1573 in occasione del Capitolo Provinciale dell'Ordine dei Frati Minori di San Francesco in Palestrina.
Di conseguenza viene stabilita la fondazione del monastero le cui spese sono sostenute da Antonio Contugi, già medico di Pio IV, e terminate nel 1575. Gregorio XIII, frequentemente presente in Frascati, segue attivamente i lavori. Nel 1579 viene consacrata la Chiesa e ultimato il Convento sempre con il costante interessamento di Gregorio XIII che si occupa in prima persona di fare spianare il terreno alle spalle del convento allestendovi un orto - giardino proprio per fargli assumere l'aspetto villa - convento, come quello delle ville adiacenti. Con Gregorio XIII si può sottolineare che l'Ordine dei Cappuccini viene decisamente potenziato in coincidenza con la fondazione del convento e della chiesa di Frascati.
Nel 1575 infatti, vengono elaborate e stampate le norme costitutive dell'Ordine dei Cappuccini che si estendono oltre il territorio italiano, svolgendo un compito di predicazione e di assistenza verso i più umili in contrapposizione all'opera esercitata dai protestanti. Tali princìpi fanno comprendere l'importanza data al convento e giustificano l'incremento della sua ricettività agli inizi del XVII secolo. Con la fine del pontificato di Gregorio XIII nel 1636 il convento perde importanza e i monaci si riducono a sole 12 unità e successivamente tale numero, salito a 20, non verrà più superato. Nel 1693 il principe Aldobrandini concede ai frati due once d'acqua e la condotta per alimentare l'orto. In una nota del 1732 scritta dal pittore Ghezzi, sempre presente nelle varie residenze della nobiltà frascatana, ricorda l'omaggio di due suoi dipinti al convento che vengono posti ai lati dell'altare maggiore. Tale legame si protrae fino al XIX secolo e ciò viene sottolineato dalla donazione di un'area con alberi nel 1824 da parte di Marianna di Savoia, duchessa di Chamblais, proprietaria della Rufinella o Villa Tuscolana, a monte del convento. Nel 1889, inoltre Francesco Aldobrandini de la Rochefoucauld provvede alla realizzazione della cripta e al restauro di una delle cappelle laterali mentre in precedenza, nel 1857, il Cardinale Antonio Maria Cagiano De Azevedo, vescovo di Frascati, provvede alla ricostruzione dell'altare maggiore. Un episodio da ricordare riguarda l'ospitalità concessa al Cardinale Guglielmo Massaia negli ultimi anni della sua vita, tra il 1880 e il 1889, il quale era stato missionario in Etiopia nel corso del XIX secolo testimoniata dalle sue memorie e dal museo ivi organizzato.
